女学院に女装して通う事になった主人公・瑞穂の波瀾万丈の学園生活を描いている。キャラメルBOXの定評ある丁寧な作りに加え、少女漫画的世界観にマッチした華麗なグラフィックとストーリー性の高いシナリオ、（男性でありながらキャラ人気投票でも高い支持を得ている）主人公を初めとする魅力的なキャラクター等が高い評価を受け、更にライバルキャラの強烈なツンデレぶりが話題となり、現在も根強い人気を持つゲームの一つである。
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宮小路瑞穂は容姿端麗・文武両道だがちょっと気弱な財閥の御曹子。彼の運命は祖父の死をきっかけに一変することになる。なんと祖父は瑞穂を女子校である聖應女学院（PS2版では聖央女学院）に転入させるとの遺言をしていたのだ。
無理矢理女装させられ男であることを隠して転入した女学院で、瑞穂はその美しい容姿と嫋やかな振る舞い、優秀な成績から、次第に生徒達の注目を集めていく。やがて、男でありながら全校生徒を代表する"お姉さま"である「エルダー・シスター」として崇められることになってしまう。
宮小路 瑞穂（みやのこうじ みずほ）
声優：神村ひな/同左/堀江由衣
誕生日：5月12日、血液型：A型、身長：173cm。
祖父の遺言で女学院に女装して転校させられてしまう主人公。本名は鏑木 瑞穂（かぶらぎ みずほ）だが、正体を隠すため学院では母方の姓を名乗っている。男性らしからぬ長髪と母親譲りの美貌の持ち主。学業面については、転校前は有名な進学校である開正学園でも学年トップだったほどで、剣道・空手・合気道・薙刀・フェンシング・ソシアルダンス・日本舞踊・茶道・華道の心得もある。そんな才色兼備な瑞穂はやがて全校生徒の憧れのお姉さま「第72代エルダー・シスター」として崇められてしまう。生真面目な性格だが、つい調子に乗ってしまってはふと我に返って後悔することもしばしば。かつては他者に関わろうとしない消極的な性格だったが、全校生徒の上に立つ「お姉さま」として様々な事件を経験し、次第に成長していく。公式HPのキャラ人気投票でも劇中同様トップの支持を得ており、「真のメインヒロイン」との声もある。
卒業後は翔陽大学に進学（やるきばこ2の貴子シナリオ・紫苑シナリオ）、周防院奏の妹七々原薫子にフェンシングを教えたりとちょくちょく学院にも顔を出している模様。
十条 紫苑（じゅうじょう しおん）
声優：木原泉/同左/松来未祐
誕生日：3月21日、血液型：AB型、身長：173cm。
瑞穂のクラスメイト。元華族である十条家の一人娘だが、それを鼻に掛けない性格。転校初日から瑞穂が男性であることを見破るが、それを承知で友人関係を築く。成績はトップクラスだが、病気のため1年留年している。前年の第71代エルダー・シスターに選ばれながら、入院によりその任を全うできなかったことを負い目に感じており、瑞穂のエルダーとしての活動を支えることでその罪滅ぼしをしようとしている。穏やかで落ち着いた性格だが、意外とイタズラ好きで、まりやと共謀して瑞穂をからかうこともある。瑞穂をして「こんな綺麗な人見たこと無い」と言わしめた美貌の持ち主。茶道部の指導役を務めるなど作法も完璧。また、意外にもフェンシングに詳しく小説「櫻の園のエトワール」ではフェンシングの審判を自ら買って出ている。病弱な女性であるが意外にも長身（瑞穂と同じ身長）で、腰まで届く美しい黒髪が特徴的。奏がお気に入りで本能的に抱きしめてしまう奇癖あり。「おボクさま」では長い髪で奏を取り込んでダルマ形態になることがある。父親は製紙会社、母親はフィニッシングスクールを経営している。
御門 まりや（みかど まりや）
声優：あおいひとみ/同左/浅野真澄
誕生日：6月8日、血液型：O型、身長：161cm。
瑞穂の親戚で幼馴染。紫苑と同じく華族の家柄だが、紫苑とは別の意味でお嬢様らしくない自由奔放な（アニメ版に於いては、声優の浅野曰く「定食屋の娘みたい」[1]）性格。過保護な両親から離れたくて学院で寮生活を送っている。ファッション・メイク関係に関心が強い。昔からよく瑞穂を女装させて遊んでいたため、今回の件にもノリノリで瑞穂の女子寮生活をセッティングし、転入後も慣れない女学院での生活を何かとフォローする。瑞穂の消極的な部分を改善する意図もあったのだが、実際に瑞穂がエルダーとして成長すると共に複雑な心境を覗かせる様になる。陸上部所属で、由佳里とは部活でも先輩後輩の間柄。夏休み前に引退したため、本編中ではほとんどまりやの部活のことは話題に出ないものの、短距離選手で、部の歴代最高記録保持者であることが明かされている。ゲーム版ドラマCDにおいて「茉莉花（まつりか：ジャスミンの一種）の君」の二つ名を持つことが明かされている。
周防院 奏（すおういん かな）
声優：木村あやか/同左/神田朱未
誕生日：8月26日、血液型：O型、身長：140cm。
少し内気な性格の下級生。幼い容姿に頭の大きなリボンと「なのですよ〜」という口調が特徴。演劇部員だがあがり症なのが悩み。寮では瑞穂の世話係。実は両親が不明で、孤児院の出身。「周防院」はその孤児院の院長の姓で、奏が院長の養女となったときに付けられたもの。本来の姓は不明。奨学金を得て学院に通っている努力家。頭のリボンは院長から亡くなる直前に貰った物で、何よりも大切にしているが、このリボンが原因で生徒会との間に一悶着が起きてしまう。イチゴが大好物で、それが絡むと性格が変わってしまうことも。アニメ版EDと「おボクさま」ではリボンを羽ばたかせて飛行する。
奏ルートのエピローグでは、「白菊の君」という二つ名と共に演劇部部長にして「第74代エルダー・シスター」として全校生徒から慕われている。
上岡 由佳里（かみおか ゆかり）
声優：松永雪希/同左/松本彩乃
誕生日：2月18日、血液型：A型、身長：152cm。
陸上部員である後輩。部では長距離の選手。料理が得意でハンバーグに目がない。寮ではまりやの世話係。勉強は苦手。ごく普通の家庭で生まれ育ったため、自分が「お嬢様」らしくないというコンプレックスを抱いている。大の怖がりでお化けや怖い話、飛行機が苦手。実はエッチなことへの興味が強く、そこをまりやに見抜かれて色々と弄られる羽目に。亡くなった義姉も学院OGで、由佳里の学院入学を応援していた。
奏ルートのエピローグでは、「琥珀の君」の二つ名を持つ陸上部部長兼生徒会長となっていた。
厳島 貴子（いつくしま たかこ）
声優：佐本二厘/同左/たかはし智秋
誕生日：11月16日、血液型：B型、身長：165cm。
生徒会長。瑞穂の編入以前はエルダー最有力候補だった。学院の伝統を非常に重んじており、それ故に学期途中の転入から間もなくしてエルダーになった瑞穂に不快感を示す。実は瑞穂とは家同士がライバル関係にある。また、まりやとは幼等部の頃から同級生にして犬猿の仲で、顔を合わせるとお互いに喧嘩腰になってしまう。エルダー選挙後も、生徒会長としての立場上、瑞穂達と対立してしまうことが多かったが、様々な事件を通じて次第に瑞穂の人柄に惹かれていく。真面目で公平な人柄から生徒会長としての人望は厚い。家庭の事情から大の男嫌いで、自分が厳島家の人間であることに嫌悪感を抱いている。生粋のお嬢さまなので少々世間知らず。幽霊やお化けなどが苦手。また興奮しすぎると気絶することがあり、特に個別シナリオでは事ある毎に倒れる。アダルトゲーム界を代表するツンデレキャラの一人。初回特典絵本「ツンデレラ」は彼女が主役である。
高島 一子（たかしま いちこ）
声優：草柳順子/同左/後藤邑子
誕生日：11月24日、血液型：B型、身長：154cm。
かつて学院の生徒だったが在学中に病死、とある理由から幽霊となって寮に住み着いている。明るい性格だがロマンチストな面も持つ。幽霊であるが故に物を掴むことができずにすり抜けてしまうが、人（魂のあるもの）に触ることはできる（アニメ版では、自分から触れたいと思う相手にしか触れることが出来ない）。普段は普通の喋り方だが、感情が高ぶると物凄い早口で喋り倒す癖がある。瑞穂の母親である幸穂とは浅からぬ縁がある。
地縛霊であるため移動可能な範囲は限られる（この点もアニメ版では若干異なる）。また、彼女が死んだのが夏だったため、他のキャラクターが冬服に衣替えしても彼女は夏服のままである。
憑依能力を持ち、その特殊な作用が瑞穂の危機を救うこともある。
梶浦 緋紗子（かじうら ひさこ）
声優：一色ヒカル/同左/榊原ゆい
誕生日：1月8日、血液型：AB型、身長：168cm。
瑞穂のクラスの担任を務める古文の教師。学院長、教頭と共に瑞穂が男性であることを知っている学校関係者の一人。シスター資格を持つ学院OGだが、実は不信心な性格。後述の長谷川詩織とは浅からぬ縁があった。何かにつけて瑞穂に薄荷のキャンディーをくれる。始業式や卒業式などの式典では必ず彼女が司会進行を勤めており、他の教師はまったく登場しないが、これは彼女が好きでやっているという噂。眼鏡っ娘。
サブキャラクター
小鳥遊 圭（たかなし けい）
声優：一色ヒカル/釘宮理恵/真堂圭
瑞穂のクラスメイト。オカルトや占いに関する造詣が深く、意味深なことを無表情で言う。また他人を驚かせることに無駄に一所懸命になったりする。演劇部の鬼部長（新入生のときから部長を務めていた）で、中性的な容姿から劇では男性役を演じることも多いためか、一般生徒の間での人気も高く、ファンクラブもあるらしい。奏を文化祭の劇で主役に抜擢したのはこの人で、奏からは尊敬されている。美智子とはいわゆる百合の関係で、彼女の方が基本的に「ネコ」である。
ちなみに同じキャラメルBOXのゲーム『終末少女幻想アリスマチック』にも、原画家が異なるものの容姿が似た同姓同名のキャラクターが登場する（声優は理多）。使う魔術もほぼ同じ。（やるきばこ１、卒業旅行に行こう！参照）
高根 美智子（たかね みちこ）
声優：神村ひな/福井裕佳梨/野川さくら
瑞穂のクラスメイト。教室の出入り口に一番近い席に座る関係上、クラスの受付嬢（来客係）を務める。見かけによらず策略家であり、さらに前述の通り受付嬢を務めているので、クラスメイトの交友関係はすべて把握している。圭とは百合の関係で、彼女の方が基本的に「タチ」である。後、嫉妬深い。立ったまま気絶（やるきばこ１参照）するなど器用。
菅原 君枝（すがわら きみえ）
声優：草柳順子/日笠山亜美/木村まどか
生徒会会計。貴子を慕い補佐する後輩。まりや曰く「貴子の腰巾着やってるデコメガネ」。実は相当な美少女であることが、貴子ルートで判明する。貴子のために瑞穂の身辺を洗うが、瑞穂の悪い噂を掴むことが出来ない上、彼女と瑞穂との間に起こる幾つかのハプニングで、瑞穂への気持ちに変化が現れる。また、彼女が起こした幾つかの行動が、結果的に貴子と瑞穂との間を急速に縮めることになる。おまけシナリオでは、貴子への崇拝と瑞穂への憧憬との間で揺れ動く心情と、その結果の意外な行動が描かれている。
貴子ルートの後日談を描いた『櫻の園のエトワール』では、「かぐやの君」という二つ名で呼ばれる生徒会長兼「第73代エルダー・シスター」となる。その後発売された「やるきばこ2」収録の貴子シナリオにおいても、君枝がエルダーになっていると言及される場面がある。
長谷川 詩織（はせがわ しおり）
声優：佐本二厘/柚木涼香/登場せず
緋紗子の学生時代の後輩。音楽特待生でピアノが得意。無愛想で友人も少なかったが、緋紗子とは仲が良く、いわゆる百合関係であった。
美倉 サヱ（みくら さゑ）
声優：あおいひとみ/同左/堀越真己
学院長を務める老シスター。男性である瑞穂の編入を許可した。瑞穂の母親や緋紗子はかつての教え子であり、瑞穂達を温かく見守る。ゲーム中のテキスト及びアニメのクレジットでは「学院長」と書かれているのみで、本名は明かされない。CD-ROM版の操作説明書こと「恵泉女学院入学許可証」の署名欄における学院長名としてフルネームが登場するのみで、マニュアルの形態が異なるDVDフルボイス版やPS2版では明示されていない。
門倉 葉子（かどくら ようこ）
声優：松永雪希/同左/未公表
クールな性格の生徒会副会長。学年は君枝と同じ。立ちグラフィックは一般生徒（モブキャラクター）用のものを使い回しているが、それらとは別人物なので注意が必要である。アニメ版にも彼女らしき生徒会役員が登場している。貴子シナリオでは、順当に行けば次年度の生徒会長となるところを、自分は黒幕でいたいとして君枝を会長職に推し、自らは副会長に留まる。『櫻の園のエトワール』でも、もう一年副会長を務めることとなっている。『櫻の園のエトワール』時の二つ名は「帝の君」。
烏橘 可奈子（うきつ かなこ）
声優：木村あやか/同左/未公表
間延びした口調が特徴の生徒会書記。ゲーム中では語られていないが、奏や由佳里と同学年の新入生である。葉子と同じくグラフィックは一般生徒用と同じものだが、PS2版では大幅にデザインが変更されている。アニメ版にも彼女らしき生徒会役員が登場している。辛辣なことを言う葉子と、それを天然ボケで受け流す可奈子は良いコンビだと、貴子や瑞穂も認めている。『櫻の園のエトワール』では葉子と同じく2年連続で書記を務め、最終年度は副会長となっている。
香原 茅乃（こうはら かやの）
声優：一色ヒカル/同左/未公表
華道部部長。まりやや華道の講師の資格を持つ紫苑とは面識がある。グラフィックは一般生徒用のものと同じ。アニメ版では生徒会役員（もう1人の書記であると生徒会室のホワイトボードの文字より推測できる）として彼女らしき人物が登場している。
宮小路 幸穂（みやのこうじ さちほ）
声優：神村ひな/同左/台詞なし
瑞穂の母親。慶行との結婚後は鏑木姓。瑞穂が幼い頃に病死している。学院のOGであり、22年前のエルダー・シスターを務めていた。また高校卒業と同時に結婚が決まっていた。学院時代に高島一子とは浅からぬ縁があった。一子によると、瑞穂とそっくりの容姿をしていたそうで、ゲーム中でも彼女は瑞穂のCGが流用されている。愛息・瑞穂が男性らしからぬ長髪なのは幸穂が亡くなる間際に「この子の髪を切らないで下さい」と遺言したため。
鏑木 慶行（かぶらぎ よしゆき）
声優：未公表（やるきばこ2ではボイスなし）/ボイスなし/登場せず
瑞穂の父親。現鏑木グループ当主。本編では台詞のみの登場だったが、「やるきばこ2」収録のおまけシナリオで初めてビジュアルが登場した。豪放な性格だが、事業家としては実利主義。質素倹約を旨としており、その影響で瑞穂には御曹司らしからぬ庶民的な金銭感覚（まりや曰く「貧乏性」）が身に付いている。
鏑木 光久（かぶらぎ みつひさ）
声優：未公表/ボイスなし/登場せず
瑞穂の祖父で、この人物の遺言を基点に物語が始まる事になる。ゲーム内では言及されていないが、息子の妻である幸穂を大変気に入っていたらしく、自身の遺言を利用して孫の瑞穂を女学院に編入、寮内での個室位置指定、家具の変更を認めないなどの要望を残しているが、実際には幸穂の願いであったという見方が有力である[要出典]。
久石（ひさいし）
声優：未公表/ボイスなし/永野善一
瑞穂の亡き祖父・光久の顧問弁護士。女学院への編入というとんでもない遺言を瑞穂に伝えた。端役だが、本編では瑞穂以外では唯一名前（名字）とビジュアルが揃っている男性キャラクターである。余談だが冗談を言わない人。
おまけシナリオ・ドラマCDより登場
織倉 楓（おりくら かえで）
声優：海原エレナ/同左/小林沙苗
鏑木家の家政婦長で、慶行の筆頭秘書。幼いころに母親を亡くした瑞穂にとっての母親代わりでもある。年齢不詳であるが、「やるきばこ2」の紫苑シナリオ（本編の2年後）の時点でぎりぎり20代らしい。メイドらしい品位と茶目っ気とを併せ持つ。メイドとしての技量は完璧だが、瑞穂によると稀に大失敗をやらかすらしい。紫苑とは似た者同士で意気投合する。奏と同じ孤児院の出身で、「やるきばこ2」の貴子シナリオにおける瑞穂の台詞によれば約15年前から一緒に暮らしているらしい。
本編には未登場だが、「楓さん」という人物の存在自体は瑞穂の台詞により明かされていた。「やるきばこ」「やるきばこ2」収録のおまけシナリオ、アニメ版ドラマCDシーズン02に登場。
桜井 夏央（さくらい なお）
声優：榊原ゆい（ゲーム版ドラマCDに登場）
陸上部所属で、まりやの後輩。「秋桜（コスモス）の君」の二つ名を持つ。まりやに「特別な感情」を抱いている。
西岡（にしおか）
声優：ボイスなし
鏑木家のお抱え運転手。妻と共に鏑木家に住み込む。運転の技能に長け、長尺リムジンを手足のように操る。ビジュアルは描かれていない。
蕎麦打ちが趣味で、弟が収穫した蕎麦を打つ。その事は長らく内緒にしていたが、楓の知るところとなり、その年より鏑木家の年越し蕎麦となった。
本編には未登場。「やるきばこ」収録のおまけシナリオ「宮小路家のお正月」に登場。「やるきばこ2」収録の紫苑シナリオにもほんの僅かながら登場して台詞がある。
厳島 順崇（いつくしま かずたか）
声優：ボイスなし
「やるきばこ2」の貴子シナリオに登場。厳島の嫡男で貴子の兄。放蕩や女性遍歴で悪名高く、貴子にも嫌悪されているが、シナリオを進めると意外な素顔が明らかになる。
松下 桃子（まつした ももこ）
声優：北都南
身長：145cm。
「やるきばこ2」収録の紫苑シナリオに登場。瑞穂と同じ翔陽大学の1年先輩（年齢は同じだが、瑞穂が1年浪人しているシナリオ設定のため）。学生会副会長。関西弁を喋る元気娘だが、幼い外見を気にしている。隼人とは良きケンカ友達だったが…。
黒澤 隼人（くろさわ はやと）
声優：ボイスなし
身長：183cm。
「やるきばこ2」収録のおまけシナリオに登場。瑞穂の大学入学時期の都合でシナリオにより設定が異なる。
翔陽大学の三回生で学生会長。軽い性格だが学生会長としての信任は厚い。上に姉が3人いる境遇で育ったため、女性に対して醒めた見方をする。埼玉県民。（紫苑シナリオ）
翔陽大学の二回生で学生会副会長。瑞穂や貴子と同じ経済学部の所属でゼミの1年先輩。（貴子シナリオ）
高島（たかしま）
声優：ボイスなし
「やるきばこ2」の紫苑シナリオに登場。鏑木家の主治医。瑞穂の祖父の代からの付き合いで、慶行すら子供扱い。ビジュアルは描かれていない。
小説「櫻の園のエトワール」より登場
主要人物のみ記載する。
七々原 薫子（ななはら かおるこ）
新入生として聖應女学院に編入。小さな頃に母親を亡くし、それ以来父親に男手一つで育てられたためかなりガサツな性格である。身長は170センチ以上あり、剣道三段の腕前。寮では奏と姉妹になるが、一般生徒からは逆転姉妹と呼ばれる。それが元で一部の生徒に嫉妬され、フェンシング部エースの一条和枝とフェンシングで決闘をすることとなるが、瑞穂の指導もあって勝利を収め、「騎士（ナイト）の君」の二つ名を頂く。
皆瀬 初音（みなせ はつね）
幼等部からの生粋の聖應女学院生徒。父親のニューヨーク転勤により家族は海外に移るが、初音は聖應に残したいという両親の希望もあり女子寮に入る。かなりの人見知り。寮では由佳里の妹で、由佳里にあこがれ陸上部に入部する。由佳里の初音への親密な指導に端を発した部長禅譲事件（陸上部事変）が、翌年の由佳里の生徒会長就任の呼び水となった。その際彼女自身は書記として生徒会に入っている。
真行寺 茉清（しんぎょうじ まきよ）
中等部時代から「王子さま」と呼ばれ人気者であった。薫子の1・2年生の時のクラスメイトで友誼を結ぶ。眼鏡っ娘。
大谷 京花（おおたに きょうか）
薫子の1年生の時のクラスメイトでクラスの中心人物。茉清のファンであったがために彼女と友誼を結んだ薫子に嫉妬していたが、ある事件を境に、薫子の信奉者になる。
鷲尾 緑（わしお みどり）
君枝と同学年で奏が2年生の時の演劇部部長。
ケイリ・グランセリウス（けいり・ぐらんせりうす）
薫子・初音の1年下の代の生徒でイギリス人らしい。日本とイギリスを往復する生活をしているが、家庭教師について勉強したのみなので、聖應が初めての集団生活となる。外国人であることに加え、集団生活の習慣がないため各所で軋轢を起こす。自称「夜に在り、数多星々を司る星の王女（星の王女）」。僅かに褐色がかった肌にブルネットの髪、エメラルドグリーンの瞳を持つ。
魚住 響姫（うおずみ ひびき）
奏と同学年で放送委員長。第74代エルダー選挙のファイナリストでもある。放送委員会の院内放送金曜（クラシック音楽）担当で二つ名は「セイレーンの君」。1年生の時に奏の学院祭での演技（特に声の力）を見て憧憬を覚え、放送委員会に入る。そのため、エルダー選挙では"正しく"憧憬の対象である奏に得票を譲った。眼鏡っ娘。
片平 斎（かたひら いつき）
君枝が生徒会長を務めた代の会計職。君枝や葉子と同じクラス。
烏橘 沙世子（うきつ さよこ）
可奈子の一つ年下の実妹。ほわんほわんした姉とは対照的にキビキビとした口調。会計を片平斎より引き継ぐ。顔は可奈子にそっくりだが、目つきが鋭い。眼鏡っ娘。